Ферментируемые корма (силос, сенаж, силаж и др.) являются одними из наиболее востребованных кормов для жвачных животных в мире [1]. Основным методом консервирования растительных кормов, обеспечивающим сохранность питательных веществ, витаминов и энергетической ценности, является силосование [2]. В связи с этим исследования, направленные на обеспечение условий заготовки высококачественных ферментируемых кормов, необходимы для получения высоких показателей продуктивности и экономической эффективности животноводства [3].
В основе силосования лежат сложные микробиологические процессы, которые играют ключевую роль в ходе ферментации, определяя тем самым качество получаемого корма. По современным представлениям, микробное сообщество силоса представляет собой сложную смесь бактерий, дрожжей и микроскопических грибов с количеством колониеобразующих единиц от 105 до 109 КОЕ × г-¹ [4]. Молочнокислые бактерии относятся к числу наиболее значимых микроорганизмов, участвующих в ферментации, что обусловливает их широкое применение для создания биоконсервантов при заготовке кормов. Сообщалось, что штаммы бактерий (лактобактерии, бациллы и др.), на основе которых разрабатывают биоконсерванты, позволяют ускорять процессы ферментации. Указанный эффект обусловлен высокими темпами роста данных микроорганизмов, их резистентностью к пониженным значениям pH и способностью к быстрому синтезу кислот при широком диапазоне температурных колебаний [5; 6]. Так, использование штаммов лактобактерий, устойчивых к низким температурам, позволило оптимизировать ферментативные процессы и получить высокую сохранность питательных веществ при консервировании овсяного силоса высокой влажности [7]. По мнению ученых [8], поиск перспективных штаммов для использования в качестве консервантов для силосования должен быть основан на изучении естественной эпифитной микробиоты, прежде всего, молочнокислых бактерий.
В последние годы, благодаря развитию современных молекулярно-генети-ческих методов, исследователи выявили на кормовых культурах и в готовых ферментируемых кормах не только молочнокислые бактерии, но и широкий спектр других микроорганизмов, включая некультивируемые. Применение современных методологических подходов позволяет более детально изучить микробные процессы, лежащие в основе ферментации силоса, и разработать новые технологии для повышения его питательности и качества [9; 10].
Микробиом силоса является важным индикатором его качества. Необходимо отметить, что присутствие определенных видов микроорганизмов существенно зависит от доступных метаболитов, состав которых определяется растительной массой, используемой для заготовки корма. Для получения ферментируемого корма применяют различные виды кормового сырья, для которых необходим поиск наиболее эффективных штаммов. В связи с этим перспективным является изучение взаимосвязи между составом метаболитов и составом микробного сообщества, формируемого в ходе ферментации, что важно для скрининга перспективных консервантов. Полученные результаты будут востребованы не только для оценки качества ферментации, но и для выявления питательных и функциональных метаболитов, полезных для здоровья и продуктивности животных.
Современный перечень подходов к оценке состава микробных сообществ растений и кормов на их основе включает широкий спектр методов. Посев микроорганизмов на селективные питательные среды и оценку биохимического профиля штаммов относят к культуральным методам. Среди молекулярно-гене-тических методов, не зависящих от этапа культивирования, известны методы количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирование, полиморфизм длин терминальных рестрикционных фрагментов и другие [11; 12].
Метод количественной ПЦР (кПЦР) является одним из наиболее быстрых и перспективных подходов, позволяющих оценивать количество определенных таксонов (например, видов или штаммов бактерий и грибов) в ходе консервирования кормов. Количественная ПЦР, нацеленная на анализ гена 16S рРНК, впервые была использована для оценки развития популяций Lactobacillus planta-rum в силосе [13].
Метод кПЦР может быть использован для количественного анализа и мониторинга динамики микробного сообщества на протяжении всего процесса силосования. Кроме того, с помощью данного подхода можно идентифицировать как грибы, продуцирующие микотоксины, так и бактерии, вызывающие инфекционные заболевания у животных и человека (например, Listeria или Clostridium). Возможность детекции указанных микроорганизмов может быть использована для разработки методов снижения их количества в силосе.
Достижения в области глубокого секвенирования с использованием различных платформ (например, Illumina, Roche 454, Ion Torrent, PacBio) позволяют проводить метагеномное секвенирование микробной ДНК, выделенной из растительного сырья, ферментируемой массы в процессе консервирования, силоса [14; 15] и кормов, подвергнутых аэрации [16], и химуса [17].
Методы метагеномики позволили расширить представления о сложности микробной экологии при силосовании благодаря таким преимуществам, как анализ геномов микроорганизмов без необходимости их культивирования [18]. Применение этих методов дало возможность охарактеризовать роль эпифитных популяций в формировании микробиома силоса, а также оценить, как консерванты на основе микроорганизмов влияют на питательность и качество готового корма.
Метагеномные исследования подразумевают проведение высокопроизводительного секвенирования образцов. Эти методы подразделяются на два основных типа: секвенирование ампликонов отдельных/маркерных генов (например, ген 16S рРНК у прокариот) и метагеномный анализ всего генома. Оба подхода позволяют оценивать все микробное сообщество, включая некультивируемые виды, и могут обеспечить получение глубокой характеристики микробного разнообразия в экосистемах.
Секвенирование маркерных генов позволяет оценивать таксономическую и филогенетическую идентификацию микроорганизмов в сложных экосистемах с меньшими затратами времени и вычислительной мощности (∼50000 прочтений/образец), чем метагеномное исследование всего генома. Другим преимуществом указанного подхода по сравнению с полногеномным анализом является его более низкая стоимость и отсутствие загрязнения нецелевой ДНК вследствие проведения специфической амплификации консервативных регионов (например, гена 16S рРНК). Основными ограничениями указанного типа анализа являются праймер-зависимые искажения, которые могут приводить к смещению разнообразия в сторону определенных членов микробных сообществ и искажать количественную оценку их разнообразия [19]. Кроме того, секвенирование таргетных участков ДНК микроорганизмов часто не позволяет проводить их идентификацию до уровня штамма или даже вида. В связи с этим использование полноразмерных генов 16S рРНК (∼1500 пар нуклеотидов ) считается золотым стандартом для точной таксономической идентификации [20]. Для получения полноразмерных высококачественных прочтений требуется более дорогостоящее секвенирование с помощью прибора Pacific Biosciences RSII, стоимость одного прочтения которого значительно выше, чем при секвенировании более коротких регионов, таких как V1-V3 или V3-V5, с использованием платформ для коротких прочтений, таких как Illumina MiSeq или Ion Torrent [21]. К другим недостаткам секвенирования маркерных генов или ампликонов для многокомпонентных сообществ является необходимость использования разных праймеров. Тем не менее, последние достижения в анализе микробных сообществ с использованием высокопроизводительного секвенирования позволили существенно расширить представления о сложности микробиологии силоса [22].
Необходимо отметить, что большинство исследований в настоящее время ограничивается изучением филогении микроорганизмов с использованием консервативных областей их генома (например, ген 16S рРНК, ITS). Эти исследования позволяют получить обширную информацию о микробной экологии силоса, однако они дают ограниченные сведения о функциях микробных видов, участвующих в процессе силосования.
В связи с этим было разработано несколько инструментов для функционального прогнозирования микробного сообщества на основе анализа ампликонных последовательностей, в том числе PICRUSt, Tax4Fun, FAPROTAX, BugBase и FUNGuild. Данные инструменты биоинформатического анализа становятся все более популярными в исследованиях микробной экологии [23].
Так, программный комплекс PICRUSt2 содержит обширную базу данных семейств генов и референсных геномов [24]. В частности, исследователи с применением программы PICRUSt2 при оценке прогнозируемой функциональности бактериальных сообществ в силосе из кукурузы [25] обнаружили, что функции транскрипции, трансляции, репликации и репарации бактериального сообщества были повышены, а метаболизм аминокислот в силосе спустя 60 дней после окончания консервирования — понижен. Таким образом, применение данного подхода позволяет оценивать потенциал микробных сообществ силосной микробной экосистемы в связи с различными факторами, в том числе с применением биоконсервантов.
Второй тип метагеномного анализа основан на проведении полногеномного секвенирования всей ДНК, выделенной из образца, что обеспечивает получение полной генетической информации о микробных сообществах, а также геномных связях между функцией и филогенией некультивируемых организмов [26]. Еще одним преимуществом данного подхода перед методом секвенирования ампликонов является возможность избежать праймер-зависимых искажений результатов. Также существенным преимуществом подхода является возможность не только получить информацию о составе микробного сообщества, но и изучить его потенциальные функции. К недостаткам подхода относится очень высокая стоимость, связанная с необходимостью глубокого секвенирования, для которого необходимы миллионы прочтений последовательностей ДНК, а также необходимость использования для анализа данных сложных биоинформатических приемов и программных комплексов, таких как Trimmomatic software [27], CLARK [28] и Taxonomer [29].
Таким образом, современные молекулярные подходы позволяют детально охарактеризовать микробные сообщества растительного сырья и фазы микробной ферментации. На следующем этапе для характеристики процесса консервирования высокой перспективой обладают подходы метатранскриптомики. Они могут способствовать получению данных о влиянии различных факторов на экспрессию генов, кодирующих ферменты, задействованные в синтезе и метаболизме органических кислот, протеолизе или образовании микотоксинов в ходе ферментации или хранения корма. Например, этот подход использовался для оценки способности микробиома крыс к детоксикации охратоксина А [30], который часто встречается в силосе [31]. Одним из актуальных направлений является оценка экспрессии генов, связанных с образованием и деградацией микотоксинов для разработки эффективных путей снижения их количества в силосе. Сведения об экспрессии генов, кодирующих антимикробные вещества (например, бактериоцины), могут позволить расширить представления о потенциале снижения количества бактерий, вызывающих порчу кормов или негативно влияющих на здоровье животных. Оценка транскрипции генов, кодирующих ферменты, участвующие в деградации углеводов, может стать основой для получения новых знаний о роли микробных сообществ в процессе деградации клеточной стенки растений. Эти знания могут быть использованы для повышения усвояемости силоса животными. Помимо этого, изучение транскриптома позволит оценить эффективность применения различных штаммов в силосе, а также их влиянии на его сохранность.
Анализируя исследования в сфере применения молекулярно-генетических методов, в частности секвенирования нового поколения (NGS) и ПЦР-анализа, необходимо отметить целый спектр направлений, которые позволяют открывать новые горизонты в разработке наукоемких технологий консервирования и селекции высокоэффективных штаммов бактерий.
Одним из наиболее актуальных направлений является использование молекулярно-генетических методов для изучения разнообразия и функционирования микробных сообществ при силосовании растительной массы. При этом высокую значимость приобретает скрининг микробиоты на различных этапах консервирования кормов с применением молекулярно-генетических подходов. Так, например, применение молекулярных методов позволяет выявлять некуль-тивируемые штаммы условно-патоген-ных и патогенных бактерий в ходе ферментации и в готовом корме. Полученные данные востребованы для скрининга новых штаммов с высокой антагонистической активностью против нежелательных микроорганизмов с целью разработки новых биоконсервантов.
Применение технологий молекулярно-генетического анализа позволило детализировать изменения, происходящие в ходе силосования различных культур. Согласно современным данным, наиболее часто выявляемыми в силосе являются бактерии филы Firmicutes и родов Pediococcus, Proteobacteria, Pseudomonas и Weissella [32].
Установлено, что на процесс ферментации растительной массы, а также на микробное разнообразие и питательность силоса влияют различные факторы: вид растений, температура окружающей среды, внесение консерванта. Доказано, что тип растительного сырья оказывает значительное влияние на численность и разнообразие бактерий при ферментации [33]. Так, например, было выявлено, что доминирующими в кукурузном силосе были виды Pantoea agglomerans, Pseudomonas spp., Pseudomonas koreensis, Serratia liquefaciens и Pseudomonas coleopterorum, тогда как бактерии Acinetobacter spp., P. agglo-merans, Enterobacter spp., Streptomyces alboniger и L. plantarum обнаруживались в нем в меньшей степени.
В исследовании [34] сообщается, что температура окружающей среды оказывает значительное влияние на бактериальное разнообразие и ход ферментации растительной массы. В силосе при 30 ºC существенно повышалась представленность условно-патогенных бактерий родов Pseudomonas, Exiguobacterium и Acinetobacter, доля которых оставалась низкой при 15 ºC. Также отмечалось [35], что добавление молочнокислых бактерий в качестве консерванта приводило к улучшению качества ферментации силоса из люцерны при температуре 20 и 30ºC, тогда как при температуре 40ºC процессы консервирования ухудшались. Полученные результаты позволили установить, что более низкая температура (от 15 до 30ºC) может являться эффективным элементом технологии заготовки объемистых кормов, способствующим подавлению распространения нежелательных микроорганизмов в силосе.
В целом, с применением молекулярно-генетических подходов выявлено, что на микробиологические процессы при ферментации способны оказывать влияние многие факторы.
В числе перспективных направлений оптимизации процессов ферментации растительной массы является поиск штаммов для разработки высокоэффективных биоконсервантов. Одним из путей скрининга новых микроорганизмов в качестве основы для заквасок является идентификация доминирующих таксонов в силосе, например, молочнокислых бактерий, что позволяет выделять штаммы, адаптированные к конкретным видам агрофитоценозов и климатическим условиям, с высокой конкурентоспособностью. Сообщалось, что применение биоконсервантов на основе бактерий родов Lactobacillus, Bacillus приводит к коррекции процессов ферментации растительной массы. Это связано с реорганизацией бактериальных сообществ, что приводит к улучшению состава продуктов ферментации. В настоящее время одними из наиболее перспективных являются бактериальные консерванты на основе молочнокислых бактерий, поскольку их использование приводит к повышению количества представителей рода Lactobacillus и снижению микробного разнообразия в ферментируемой массе. В частности, установлено, что применение биоконсервантов на основе штаммов лактобактерий приводило к увеличению в силосе содержания молочной кислоты, аминокислот, а также снижению значений pH и количества аммиачного азота. Так, добавление L. plantarum при силосовании эспарцета способствовало повышению количества бактерий видов L. acetotolerans, L. buch-neri, L. plantarum, L. pentosus и Clostri-dium tyrobutiricum [36]. Также отмечалось наличие отрицательной корреляции между присутствием в силосе видов лактобактерий L. buchneri, L. plantarum, L. paralimentarius, L. buchneri и L. no-densis и присутствием представителей Erwinia sp., Ewingella americana и L. acetotolerans, которые могут выживать в условиях более низкого pH. При этом выявлено, что бактерии семейства Enterobacteriaceae способны выживать и конкурировать с молочнокислыми бактериями за использование водорастворимых сахаров в качестве основного источника энергии [37]. Известно, что представители Enterobacteriaceae метаболизируют молочную кислоту в ацетат, сукцинат, а также способствуют накоплению эндотоксинов [38; 39].
Еще одним направлением применения молекулярно-генетических методов исследований является разработка и поиск эффективных приемов для получения ферментируемых кормов с высокой аэробной стабильностью. Проведенные исследования позволили охарактеризовать закономерности изменений микробного сообщества ферментируемых кормов при аэрации. Так, с применением метода NGS-секвенирования [40] в ходе оценки аэробной стабильности кукурузного силоса в течение 14 дней наблюдался резкий рост содержания Bacillales (с 1 до 43 %) на фоне сокращения количества Lactobacillales, Enterobacteriales и других таксонов. Аналогичные данные, свидетельствующие о замещении лактобактерий представителями Clostridiales в силосах из кукурузы и злаковых культур, получены с помощью методов DGGE и T-RFLP [41]. Однако в экспериментах с силосом из люцерны [42] аэрация, напротив, приводила к повышению представленности лактобацилл при общем снижении микробного биоразнообразия.
В настоящее время существует ограниченное число публикаций, где метод NGS-секвенирования использовался для анализа грибных сообществ в силосе. В одном из исследований [43] показано, что среди доминирующих семейств микромицетов в силосуемой массе среди Ascomycota преобладали представители Davidiellaceae (26,9 %), Pleosporaceae (5,1 %) и Pleosporales (2,3 %). В готовом силосе в грибной популяции стали доминировать представители Ascomycota (97,4 %). Основными идентифицированными семействами стали Pichiaceae (61,9 %), Trichocomaceae (7,9 %) и OTU порядка Saccharomycetales (13,9 %).
С применением молекулярно-генети-ческих подходов также проводились исследования, направленные на изучение роли эукариотических микроорганизмов в процессе силосования. Особое внимание уделялось их вкладу в аэробную порчу силоса, синтезу микотоксинов, а также связанными с этими процессами рискам для безопасности кормов [44].
Отмечалось, что структура грибных сообществ, развивающихся при аэробном воздействии, в значительной степени зависит от типа силоса. Было показано, что сообщества микромицетов в силосе из райграса, подвергнутом аэробному воздействию в течение семи дней, состояли из представителей видов Pichia anomala, Pichia burtonii, S. Cerevisiae и Penicillium roquefortii [43]. Было продемонстрировано, что сообщества микромицетов, в отличие от бактериальных, не претерпевают столь же существенных изменений, поскольку кислые и анаэробные условия неблагоприятны для роста грибов. Однако многие виды микромицетов, очевидно, переходят в спящее, но жизнеспособное состояние во время силосования и активизируются при воздействии аэробных условий.
Таким образом, применение молекулярно-генетических методов, основанных на технологиях ПЦР-анализа, высокопроизводительного секвенирования и биоинформатического анализа таксономической и функциональной характеристики микробных сообществ, имеет перспективы, поскольку позволяет на новом уровне охарактеризовать процессы ферментации растительной массы и механизмы изменения микробиома силоса под воздействием различных факторов.
Детальная характеристика структуры микробных сообществ и их изменений способствует расширению представлений о взаимосвязи между отдельными таксонами и биохимическими параметрами качества ферментации (концентрация органических кислот, pH, содержание аммиачного азота). Это является основой для создания эффективных технологий заготовки кормов с учетом определенных факторов, начиная от характеристики исходного растительного сырья и его эпифитной микробиоты до прогнозирования эффективности силосования при различных температурных условиях и внесении консервантов различной природы.
